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维生素C(抗坏血酸)的测定方法


抗坏血酸溶于水,稍溶于丙酮与低级醇类,结晶抗坏血酸稳定,水溶液易氧化,遇空气中氧、热、光、碱性物质,特别是在有氧化酶及痕量酮、铁等重金属离子存在,可促进其氧化破坏进程。酸性、冷藏、隔氧,可延缓食品中抗坏血酸破坏。
国内外用于食物中维生素C含量测定的主要方法有三种,即2,6-二氯酚靛酚滴定法、2,4-二硝基苯肼法和荧光法。2,6-二氯酚靛酚滴定法只能测定食物中还原型抗坏血酸。由于脱氢型抗坏血酸在人体内与还原型坏血酸具有同样的生理功能。在一般情况下,测定食物中总抗坏血酸。2,4-二硝基苯肼法和荧光法都是测定食物中总抗坏血酸含量的方法。2,4-二硝基苯肼法是比色法,易受杂质干扰,灵敏度较低,而荧光法的灵敏度高于比色法2~3个数量级。另外,2,4-二硝基苯肼法采用85%的浓硫酸作溶剂,实验时不易操作。荧光法利用硼酸对脱氢抗坏血酸的掩蔽作用可测出杂质的荧光值,从而提高方法的专一性。因此,荧光法具有灵敏度较高,选择性好,易于操作等优点,但此方法易受仪器条件的限制。所以国标方法中选用荧光法为测定食物中维生素C含量的第一标准方法,而将2,4-二硝基苯肼法作为第二法。

一、荧光法

1. 原理
样品中还原型坏血酸经活性炭氧化成脱氢型抗坏血酸后,与邻苯二胺(OPOA)反应生成具有荧光的喹喔啉(quinoxaline),其荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度在一起条件下成正比,以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

脱氢抗坏血酸与硼酸可形成复合物而不与OPDA反应,以此排除样品中荧光杂质所产生的干扰。本方法的最小检出限为0.022g/mL。
2. 适用范围
根据 GB12392—90进行检测,本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3. 仪器
(1)实验室常用设备。
(2)荧光分光光度计或具有350nm及430nm波长的荧光计。
(3)打碎机。
4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水,试剂不加说明均为分析纯试剂。
(1)偏磷酸-乙酸液:称取15g偏磷酸,加入40mL冰乙酸及250mL水,搅拌,放置过夜使之逐渐溶解,加水至500mL。4℃冰箱可保存7~10d。
(2) 0.15mol/L H2SO4:取10mL硫酸,小心加入水中,再加水稀释至1200mL。
(3)偏磷酸-乙酸-硫酸液:以0.15mol/L硫酸液为稀释液,其余同偏磷酸-乙酸液配制。
(4)50%乙酸钠溶液:称取500g乙酸钠(CH3CO ONa·3H2O),加水至1000mL。
(5)硼酸-乙酸钠溶液:称取3g硼酸,溶于100mL乙酸钠溶液中。临用前配制。
(6)邻苯二胺溶液:称取20mg邻苯二胺,于临用前用水稀释至100mL。
(7)0.04%百里酚蓝指示剂溶液:称取0.1g百里酚蓝,加0.02mol/L氢氧化钠溶液,在玻璃研钵中研磨至溶解,氢氧化钠的用量约为10.75mL,磨溶后用水稀释至250mL。

变色范围:pH=1.2 红色
          pH=2.8 黄色
         pH>4.0 蓝色


(8)活性炭的活化:加200g炭粉于1L 1+9盐酸中,加热回流1~2,过滤,用水洗至滤液中无铁离子为止,置于110~120℃烘箱中干燥,备用。
(9)标准液:
① 抗坏血酸标准溶液(1mg/mL):准确称取50mg抗坏血酸,用偏磷酸-乙酸液溶于50mL容量瓶中,并稀释至刻度。
② 抗坏血酸标准使用液(100μg/mL):取10mL抗坏血酸标准液,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL。定容前试pH,如其pH>2.2时,则应用溶液偏磷酸-乙酸-硫酸液稀释。
③ 标准曲线的制备:取下述“标准”溶液(抗坏血酸含量10μg/mL)0.5、1.0、1.5mL和2.0mL标准系列,取双份分别置于10mL带盖试管中,再用水补充至2.0mL。
5. 操作步骤
全部实验过程应避光。
(1)样品制备:称取100g鲜样,加100g偏磷酸-乙酸溶剂,倒入打碎机内打成匀浆,用百里酚蓝指示剂调试匀浆酸碱度。如呈红色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀释,若呈黄色或蓝色,则用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀释,使其pH为1.2。匀浆的取量需根据样品中抗坏血酸的含量而定。当样品液含量在40~100μg/mL之间,一般取20g匀浆,用偏磷酸-乙酸溶液稀释至100mL,过滤,滤液备用。
(2)氧化处理:分别取样品滤液及标准使用液各100mL于带盖三角瓶中,加2g活性炭,用力振摇1min,过滤,弃去最初数毫升滤液,分别收集其余全部滤液,即样品氧化液和标准氧化液,待测定。
(3)各取5mL标准氧化液于2个50mL容量瓶中,分别标明“标准”及“标准空白”。
(4)各取5mL样品氧化液于2个50mL容量瓶中,分别标明“样品”及“样品空白“。
(5)于“标准空白”及“样品空白”溶液中备加5mL硼酸-乙酸钠溶液,混合摇动15min,用水稀释至50mL,在4℃冰箱中放置2h,取出备用。
(6)于“样品”及“标准”溶液中各加入5mL 50%乙酸钠溶液,用水稀释至50mL,备用。
(7)荧光反应:取“标准空白”溶液,“样品空白”溶液及(6)中“样品”溶液各2mL,分别置于10mL带盖试管中。在暗室中迅速向各管中加入5mL邻苯二胺,振摇混合,在室温下反应35min,用激发光波长338nm、发射光波长420nm测定荧光强度。标准系列荧光强度分别减去标准空白荧光强度为纵坐标,对应的抗坏血酸含量为横坐标,绘制标准曲线或进行相关计算,其直线回归方程供计算时使用。
6. 计算

式中 x——样品中抗坏血酸及脱氢抗坏血酸总含量,mg/100g;
ρ——由标准曲线查得或由回归方程算得样品溶液浓度,μg/mL;
m——试样质量,g;
f——样品溶液的稀释倍数;
V——荧光反应所用试样体积,mL。
7. 举例
测定每一制备溶液的荧光强度。用标准溶液每1mL含2.5、5.0、7.5μg及10.0μg,各标准浓度管读数减去相应的标准空白读数的各平均值做标准曲线。
由样品液读数减去样品液空白读数之值,从标准曲线上查得相应的抗坏血酸(μg/mL),按取样量及稀释率计算样品中抗坏血酸的含量。
如:取制备好的辣椒样品2.138g,稀释到100mL,氧化后分别取10mL滤液稀释到50mL,样品读数为23.34,样品空白读数为3.188,样品读数减去样品空白读为20.152,查荧光标准曲线相当标准抗坏血酸的2.23μg。

8. 注意事项
(1)大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用偏磷酸-醋酸提取液将样品制成匀浆以保存维生素C。
(2)某些果胶含量高的样品不易过滤,可采用抽滤的方法,也可先离心,再取上清液过滤。
(3)活性炭可将抗坏血酸氧化为脱氢抗坏血酸,但它也有吸附抗坏血酸的作用,故活性炭用量应适当与准确,所以,应用天平称量。我们的实验结果证明,用2g活性炭能使测定样品中还原型抗坏血酸完全氧化为脱氢型,其吸附影响不明显。

二、2,4-二硝基苯肼法

1. 原理
总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸,再与2,4-二硝基苯肼作用生成红氏脎,脎的含量与总抗坏血酸含量成正比,进行比色测定。
2. 适用范围
根据GB 12392—90进行检测。本方法适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定。
3. 仪器
(1)恒温箱:(37±0.5)℃。
(2)可见-紫外分光光度计
(3)打碎机。
4. 试剂
本实验用水均为蒸馏水,试剂纯度均为分析纯。
(1)4.5mol/L H2SO4:谨慎地加250mL硫酸(相对密度1.84)于700mL水中,冷却后用水稀释至1000mL。
(2)85% H2SO4:谨慎地加900mL硫酸(相对密度1.84)于100mL水中。
(3)2%,2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g,2,4-二硝基苯肼于100mL4.5mol/L H2SO4内,过滤。不用时存于冰箱中,每次用前必须过滤。
(4)2% H2C2O4溶液:溶解20g草酸于700mL水中,稀释至1000mL。
(5)1% H2C2O4溶液:稀释500mL 2%草酸溶液至100mL。
(6)1%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。
(7)2%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500mL 1%草酸溶液中。
(8)1mol/L盐酸:取100mL盐酸,加入水中,并稀释至1200mL。
(9)活性炭:将100g活性炭加到750mL 1mol/L盐酸中,回流1~2h,过滤,用水洗数次,至滤液中无铁离子(Fe3+)为止,然后置于110℃烘箱中烘干。
(10)标准液:
① 抗坏血酸标准溶液(1mg/mL):溶解100mg纯抗坏血酸于100mL 1%草酸溶液中。
② 标准曲线绘制:加1g活性炭于50mL标准溶液中,摇动1min,过滤。取10mL滤液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度为2μg/mL。取5、10、20、25、40、50、60mL稀释液,分别放入7个100mL容量瓶中,用1%硫脲溶液稀释至刻度,使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1、2、4、5、8、10、12μg/mL。
按样品测定步骤形成脎并比色。
以吸光值为纵坐标,以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。
5. 操作步骤
全部实验过程应避光。
(1)样品制备:
① 鲜样制备:称100g鲜样和100g 2%草酸溶液,倒入打碎机中打成匀浆,取10~40g匀浆(含1~2mg抗坏血酸)倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。
② 干样制备:称1~4g干样(含1~2mg抗坏血酸)放入乳钵内,加入1%草酸溶液磨成匀浆,倒入100mL容量瓶中,用1%草酸溶液稀释至刻度,混匀。
③ 将上述两液过滤,滤液备用。不易过滤的样品可用离心机沉淀后,倾出上清液,过滤,备用。
(2)氧化处理:取25mL上述滤液,加入0.5g活性炭,振摇1min,过滤,弃去最数毫升滤液。取10mL此氧化提取液,加入10mL 2%硫脲溶液,混匀。
(3)呈色反应:
① 于3个试管中各加入4mL稀释液。一个试管作为空白,在其余试管中加入1.0mL 2%2,4-二硝基苯肼溶液,将所有试管放入(37±0.5)℃恒温箱或水浴中,保温3h。
② 3h后取出,除空白管外,将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温,然后加入1.0mL 2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室温中放置10~15min后放入冰水内。其余步骤同样品。
③ 85%硫酸处理:当试管放入冰水后,向每一试管中加入5mL 85%硫酸,滴加时间至少需要1min,需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出,在室温放置30min后比色。
④ 比色:用1cm比色杯,以空白液调零点,于500nm波长测吸光值。
6. 计算
同荧光法。
7. 注意事项
(1)大多数植物组织内含有一种能破坏抗坏血酸的氧化酶,因此,抗坏血酸的测定应采用新鲜样品并尽快用2%草酸溶液制成匀浆以保存维生素C。
(2)若溶液中含有糖,硫酸加得太快,溶解热会使溶液变黑。
(3)试管自冰水中取出后,颜色会继续变深,所以,加入硫酸后30min应准时比色。