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食物中维生素B12的测定方法(微生物测定法)


维生素B12的化学名称为钴胺素(cobalamin),是不含氰基的维生素分子,而一般维生素B12的药用形式为氰钴胺(cyanocobalamin),因此氰钴胺成为维生素B12的通俗名称。它是一类含钴的类咕林化合物,结构式为:

维生素为红色晶体,可溶于水,在pH4.5~5.0的弱酸条件下最稳定,强酸(pH<2)或碱性溶液中则分解。遇热可有一定程度的破坏,但快速高温消毒损失较小。遇强光或紫外线蝗被破坏。
目前,维生素B12的测定方法有多种,如薄层色谱法、电位法、高效液相色谱法、分光光度法、放射分析法、微生物法等。其中,放射分析法、高效液相色谱法常用于生物样品(如血清)中维生素B12的测定。由于维生素B12在食物中的存在形式多样,且含量较少,给测定带来了许多困难。由于微生物测定法具有灵敏度高、操作简便,适合于各种样品,因此在国际上被广泛地用于食物中维生素B12的测定。
1. 原理
维生素B12对于Lactobacillus leichmannii(ATCC 7830)的正常生长是必需的,在一定生长条件下,Lactobacillus leichmannii的生长与繁殖速度和溶液中维生素B12的含量成一定的线性关系,利用浊度法或光密度法测定细菌生长和繁殖的强度可间接地测定食物样品中维生素B12的含量。本方法最低检出限0.001ng。
2. 适用范围
本方法参考“Official Methods of Analysis of the Association of official Analyt-ical Chemists”、“Methods of Vitamin Analysis”以及“Methods of the Microbiologi-cal Analysis of Selected Nutrients”。本方法适用于测定食物及饲料中的维生素B12含量。
3. 试剂
本试验所用水均为蒸馏水,所用试剂均需分析纯试剂。
(1)甲苯。
(2)柠檬酸(C6H8O7·3H2O)。
(3)磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
(4)焦亚硫酸钠(Na2S2O5)。
(5)抗坏血酸(生化试剂)。
(6)无水葡萄糖。
(7)无水乙酸钠。
(8)L-胱氨酸(生化试剂)。
(9)dl-色氨酸(生化试剂)。
(10)10mol/L NaOH溶液:称取200g NaOH溶于适量水中,定容至500mL。
(11)(1+4)乙醇溶液:200mL无水乙醇与800mL水充分混匀。
(12) 酸解酪蛋白:称取50g不含维生素的酪蛋白于500mL烧杯中,加200mL 3mol/L盐酸,121℃高压水解6h。将水解物转移至蒸发皿内,在沸水浴上蒸发至膏状。加200mL水使之溶解后再蒸发至膏状,如此反复3次,以去除盐酸。以溴酚蓝作外指示剂,用10mol/L氢氧化钠调节pH至3.5。加20g活性炭,振摇,过滤,如果滤液不呈淡黄色或无色,可用活性炭重复处理。滤液加水稀释至500mL,加少许甲苯于冰箱中保存(该试剂也可从Difco公司购得,产品号为No.0288-15-6)。
[注意:酸解的目的是为了消除酪蛋白中的维生素,确保基本培养基中不含待测定的维生素B12,但有时酸水解不一定彻底,所以一定要选用不含维生素的酪蛋白粉(Sigma公司),这样可较好地确保酸解酪蛋白中不含维生素B12]
(13)腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液:称取硫酸腺嘌呤(纯度为98%)、盐酸鸟嘌呤(生化试剂)以及尿嘧啶各0.1g于250mL烧杯中,加75mL水和2mL浓盐酸,然后加热使其完全溶解,冷却,若有沉淀产生,加盐酸数滴,再加热,如此反复,直至冷却后无沉淀产生为止,以水稀释至100mL。加少许甲苯于冰箱中保存。
(14)维生素溶液Ⅰ:称取25mg核黄素,25mg盐酸硫胺素,0.25mg生物素,50mg烟酸,用0.02mol/L乙酸溶液溶解并定容至100mL。
(15)维生素溶液Ⅱ:将50mg对氨基苯甲酸,25mg泛酸钙,100mg盐酸吡哆醇,100mg盐酸吡哆醛,20mg盐酸吡哆胺,5mg叶酸溶于(1+4)乙醇溶液,并定容至1000mL。
(16)甲盐溶液:称取25gKH2PO4、25gK2HPO4溶于500mL水中,加5滴浓盐酸。
(17)乙盐溶液:称取10gMgSO4·7H2O、0.5gNaCl、0.5g MnSO4·4H2O,0.5g FeSO4·7H2O溶于水并定容至500mL,加5滴浓盐酸。
(18)黄嘌呤溶液:称取1.0g黄嘌呤溶于200mL水中,70℃加热条件下,加入30mL NH4OH(2+3)L-天冬酰胺溶于水中,并定容至100mL。
(19)吐温80溶液:将25g吐温-80溶于乙醇并定容至250mL。
(20)维生素B12标准溶液(均使用棕色试剂瓶):
① 维生素B12标准贮备溶液(100ng/mL):称取50μg(精度0.01mg天平维生素B12暗红色针状结晶,用(1+4)的乙醇溶液定容至500mL,贮存在2~4℃条件下。
② 维生素B12标准中间液(1ng/mL):取1mL贮备液用(1+4)的乙醇定容至100mL。贮存于2~4℃条件下。
③ 维生素B12标准使用液(0.02ng/mL):取1mL中间液用水定容至50mL,用时现配。[注意:维生素B12见光易分解,因此在配制标准液时要尽量避光,并且一定要使用棕色试剂瓶]
4. 基本培养基
(1)将下列试剂混合于500mL烧杯中,加水至200mL,以溴甲酚紫作外指示剂,用10mol/L氢氧化钠液调节pH为6.0~6.1,用水稀释至250mL。

酸解酪蛋白 25mL
腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶溶液 5mL
天冬胺酰溶液 5mL
吐温-80溶液 5mL
甲盐溶液 5mL
乙盐溶液 5mL
维生素溶液Ⅰ 5mL
维生素溶液Ⅱ 5mL
黄嘌呤溶液 5mL
抗坏血酸 1.0g
L-胱氨酸 0.1g
dl-色氨酸 0.1g
无水葡萄糖 10.0g
无水乙酸钠 8.3g

该培养基也可从Difco公司购得,产品号为No.0457-15-1。
[注意:由于国内某些试剂纯度不够,所以自行配制的培养基较浑浊,严重影响到最后的浊度测定结果,因此建议最好使用进口培养基]
(2)琼脂培养基:在600mL水中,加入15g蛋白胨,5g水溶性酵母提取物干粉、10g无水葡萄糖、2g无水磷酸二氢钾、100mL番茄汁、10mL吐温-80溶液,每500mL液体培养基加5.0~7.5g琼脂,加热溶解,用10mol/L氢氧化钠调节pH为6.5~6.8,然后定容至1000mL,分装于试管中,于121℃高压灭菌10min,取出后竖直试管,待冷却至室温后于冰箱保存。
(3)生理盐水:称取9.0g氯化钠溶于1000mL水中,每次使用时分别倒入2~4支试管中,每支约加10mL,塞好棉塞,于121℃高压灭菌10min,备用。
(4)0.4g/L溴甲酚紫指示剂:称取0.1g溴甲酚紫于小研钵内,加1.6mL0.1mol/L氢氧化钠研磨,加少许水继续研磨,直至完全溶解,用水稀释至250mL。
5. 仪器与设备
实验室常用设备。
电热恒温培养箱。
压力蒸汽消毒器。
液体快速混合器。
离心机。
硬质玻璃试管:20mm×150mm。
6. 菌种与培养液的制备与保存
(1)贮备菌种的制备:Lactobacillus leichmannii(ATCC 7830)接种于直面琼脂培养管中,在(37±0.5)℃恒温箱中培养16~24h,取出后放入冰箱中保存。每周至少传种2次以上。在实验前一天必须传种一次。[注意:Lactobacillus leichman-nii(ATCC 7830)的生命力不强,每周一定要至少传代2~3次,否则极易死亡!]
(2)种子培养液的制备:加2mL 0.02ng/mL维生素B12标准工作液和3mL基本培养基于10mL离心管中,塞好棉塞,于121℃高压灭菌10min,取出冷却后于冰箱中保存。每次制备两管,备用。[注意:加入离心管中的维生素B12标准工作液要适量,过少会阻碍Lactobacillus Leichmanni的生长,过多会使零管中的光密度值增大,影响测定结果的准确性。一般2~3mL即可]
7. 操作步骤
(1)接种液的配制:使用前一天,将已在琼脂管中生长16~24h的L.leichmannii接种于种子培养液中,在(37±0.5)℃培养16~24h,取出后离心10min(3000r/min),弃去上清液,用已灭菌的生理盐水淋洗2次,再加入3mL灭菌生理盐水,混匀后,将此液倒入已灭菌的注射器中,立即使用。
(2)水解液的制备:称取1.3g无水磷酸二氢钠、1.2g柠檬酸及0.1g焦亚硫酸钠(Na2S2O5),溶于水中并定容至100mL,用时现配。
(3)称取适量样品,至于100mL三角瓶中,加70mL水解液,混匀,于121℃高压灭菌10min,取出冷却至室温,过滤,然后以溴甲酚紫为外指示剂,用10mol/L NaOH溶解调节pH为6.0~6.1,将水解液移至100mL容量瓶中,定容至刻度。为保证最后样品测定管中的Na2S2O5的浓度≤0.03mg/mL,因此要做适当的稀释。[注意:测定管中Na2S2O5的浓度一定要小于0.03mg/mL,过多会抑制L.Leichmannii的生长,因此在称取样品时要考虑到后来的稀释倍数,避免由于稀释倍数过大造成测定管中的维生素B12含量过低,无法检出]
(4)样品试管的制备:每组平行样品管中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0mL样品水解液,并用水稀释至5mL,然后再加入5mL基本液体培养基。[注意:实验所用的所有试管必须在烤箱中180~200℃条件下干热灭菌2~3h]
(5)标准系列管的制备:每组试管中分别加入维生素B12标准工作液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL,使每组试管中维生素B12的含量为0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1ng,加水至5mL,再加入5mL基本液体培养基,需做三组标准曲线。
(6)灭菌:样品管与标准管均用棉塞塞好,于121℃高压灭菌10min。[注意:灭菌时间不宜过长,否则会破坏基本培养基中的营养成分,影响Lactobacillus Leichmannii的生长,最好在5~10min内]
(7)接种与培养:待试管冷至室温后,每管接一滴种子菌液,于(37±0.5)℃恒温箱中培养16~20h。
[注意:① 接种前,接种室要在紫外灯下消毒至少30min。② 在接种时,其中一支标准系列0管可不接种,这样可观察此次实验是否存在污染,并且可消除由于管中液体的颜色造成的误差]
(8)测定光密度值:于640nm波长条件下,以标准系列中零管调节仪器零点,测定样品管液体及标准管液体的光密度值。[注意:首先以未接种的标准系列0管进行仪器调零,然后在用接种后的标准系列0管进行2次调零,之后再测定其他管中液体的光密度值]
8. 结果计算
以维生素B12标准系列的不同质量(ng)为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线。由样品测定管中的光密度值在曲线上查出相对应的样品测定管中的维生素B12含量,再按以下公式计算样品中维生素B12含量:

式中 x——样品中维生素B12含量,μg/100g;
m1——测定管中的维生素B12含量,ng;
V——样品水解液的定容体积,mL;
f——样品液的稀释倍数;
m——样品质量,g;
100/1000——单位换算系数。
9. 注意事项
(1)全部实验操作注意避免日光直接照射。
(2)在人体肠道中,大肠杆菌可以合成维生素B12,因此,此实验极易被污染,在整个实验中,最重要的是注意清洁问题,确保所用的玻璃器皿、操作环境要清洁。