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食物及饲料中水溶性维生素K3(甲萘醌)的测定方法


1. 原理
在氨存在的条件下维生素K3(甲萘醌,VK3)与氰乙酸乙酯形成蓝色物质,在575nm下的吸光度值与维生素K3的的浓度成正比,用分光光度计测定有色物质的吸光度值,定量分析样品中维生素K3的含量。本法检出限为0.05mg。
2. 适用范围
本方法适用于强化食物及饲料中水溶性维生素K3的测定。
3. 仪器
分光光度计。
4. 试剂
本实验所用试剂均为分析级,实验用水为蒸馏水。
(1)0.1mol/L 1/2I2溶液:称取25gKI溶解于20mL水中,加入9.8g碘,混匀溶解,加水至750mL。贮存于棕色瓶中,避光保存25h。
(2)0.1mol/L Na2S2O3:将水煮沸后冷却。称取25g Na2S2O3·5H2O溶解于500mL含0.1g Na2S2O3的冷却水中,并用冷却的水稀释而1000mL。
(3)淀粉指示剂:称取2g可溶性淀粉,加于10mL水中,摇匀。然后缓慢加至200mL沸水中,煮2min。
(4)氨水+异丙醇(1+1)溶液:取异丙醇与等体积的浓氨水混合。
(5)氰乙酸乙酯(30g/L):取3g氰乙酸乙酯溶解于100mL异丙醇中。
(6)维生素K3标准溶液(0.1mg/mL):准确称取50mg维生素K3标准品,转至500mL棕色容量瓶中,用异丙醇溶解并定容至刻度。
5. 操作步骤
所有操作均需避光进行
(1)提取:准确称取约15g已混匀的样品,准确加入100mL水,搅拌10min,保证维生素K3充分溶解与混匀。过滤,如滤液浑浊,则反复过滤至澄清。
(2)氧化:吸取40mL滤液至100mL容量瓶中,加1~2滴淀粉指示剂,用0.1mol/L碘溶液滴定,至出现持续的蓝色。向溶液中滴入1滴0.1mol/L Na2S2O3消除。用水定容至刻度[注意:碘溶液的作用是作为氧化剂氧化样品中的还原性物质,多余的碘溶液可使淀粉变成蓝色,Na2S2O3则是去除多余的氧化剂,消除蓝色,以避免有色物质影响测定]。
(3)标准管和样品管的制备:分别取2套20mL比色管,分别按下表顺序加入维生素K3标准溶液、样品提取液及试剂,制备标准管和样品管。
用水定容至20mL,摇匀,放置20min。
[注:样品管和标准管中水定容的体积与显色强度、显色的稳定时间密切相关,如果定容体积过少,则色度较弱,且稳定时间短。如按本方法的操作进行,显色反应至少可以稳定2h]
标准管和样品管的制备 单位:mL

试剂 标准管 样品管
0 1 2 3 4 空白管 测定管
维生素K3标准溶液 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
样品提取液 10.0 10.0
异丙醇 3.0 1.50 1.0 0.5 0.0 3.0 2.0
氰乙酸乙酯 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
氨水-异丙醇 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

(4)比色测定:用分光光度计于575nm波长下,以标准0管作空白管,调节仪器零点,测定各管吸光度值。
6. 计算
以标准维生素K3含量作横坐标,吸光度值作纵坐标,绘制标准曲线,并计算回归方程。用样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上查出样品管的维生素K3含量,然后计算出样品中维生素K3的含量。

式中 X——样品中维生素K3的含量,mg/100g;
ma-b——样品测定管与空白管吸光度值的差值在标准曲线上对应的维生素K3含量,mg;
m——样品质量,g;
25——样品稀释倍数。
7. 注意事项
结果的允许差
(1)同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差绝对值<10%。
(2)天然食物中不含有维生素K3,只有部分强化食物可能用维生素K3作为强化剂。有文献报道人工合成维生素K3可能有一定的毒副作用,尽管目前还没有有力的证据支持这一论点,但是现在市场上应用维生素K3作为强化剂的产品较少见。饲料常用维生素K3作为维生素K的来源,所以维生素K3的测定对饲料检测和质量控制更有意义。