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蔬菜中维生素K1的测定方法(HPLC法)


天然维生素K1遇碱易分解,常规的皂化处理可严重破坏样品中的维生素K1,本方法参考AOAC方法中维生素D的前处理过程,选用磷酸盐处理过的氧化铝进行色谱分离,然后进行HPLC分析,提高了分离效果。
1. 原理
蔬菜中的维生素K1经有机溶剂提取后,经失活的磷酸盐处理过的氧化铝色谱柱进行净化,再用液相色谱法将维生素K1分离并进行定性定量测定。
2. 适用范围
本标准适用于各类蔬菜、绿色植物及其干制品中维生素K1的测定。
3. 仪器
(1)实验室常用设备。
(2)打碎机。
(3)202-R型恒温干燥箱。
(4)色谱柱:为0.8cm×30cm的玻璃柱,底端收缩变细,并装有活塞,活塞上约1cm处有一玻璃筛板,筛板孔径为16~30μm,柱上端膨大为体积约30mL的贮液池。使用前需干燥。
(5)旋转蒸发器。
与旋转蒸发器配套的旋转蒸发瓶:具塞,圆底,体积为150mL。
(6)恒温水浴锅。
(7)高纯氮气。
(8)高速离心机。
与高速离心机配套的小离心管:具塞,体积为1.5~3.0mL。
(9)紫外分光光度计。
(10)HPLC高效液相色谱仪,带紫外检测器。
4. 试剂
除特殊说明实验用水为蒸馏水,试剂为分析纯,有机溶剂使用前需重新蒸馏。
(1)无水Na2SO4:使用前需在150℃的烘箱内烘烤4~8h以去除水分。
(2)0.14mol/L Na2SO4溶液:称取20g无水硫酸钠,用蒸馏水溶解后定容至1L。
(3)丙酮:分析纯。
(4)石油醚:沸程30~60℃,分析纯。
(5)0.6mol/L碘化钾溶液:称取10g碘化钾,用蒸馏水溶解定容至100mL。
(6)5g/L淀粉液:称取0.5g可溶性淀粉,用水溶解定容至100mL。
(7)乙醚:分析纯。不含过氧化物。
① 过氧化物的检查方法:用5mL乙醚加1mL 0.6mol/L碘化钾溶液,振摇1min,如有过氧化物则放出游离碘,水层呈黄色。或加4滴5g/L淀粉液,水层呈蓝色。则该乙醚含有过氧化物需处理后使用。
② 去除过氧化物的方法:重蒸时瓶中加一段纯铁丝,弃去10%初馏液和10%残留液。
(8)洗脱液:石油醚+乙醚(97+3)。
(9)甲醇:优级纯。
(10)正己烷:优级纯。
(11)磷酸氢二钠:分析纯。
(12)中性氧化铝:100~200目。
(13)氧化铝的处理:
① 磷酸盐处理氧化铝:取250g中性氧化铝,20g磷酸氢二钠,1.6L蒸馏水,放入体积为2L的锥形瓶中沸水浴30min,不时摇动或搅拌。冷却,倒掉上层液体(包括悬浮的细小颗粒),然后用布氏漏斗抽滤。将残留物转至平底玻璃皿中,于150℃干燥箱中烘烤3~5h至2次称量相差3g以下,烘烤过程中不时搅拌,以避免结块,冷却后放入干燥器中保存。
② 失活处理氧化铝:使用前,将磷酸盐处理的氧化铝,加入具塞锥形瓶中。每100g氧化铝加9.0mL支离子水,盖紧瓶塞,蒸汽浴或80℃干燥中热3~5min,剧烈摇动锥形瓶,使氧化铝可以自由流动,无结块。冷却,静置30min,使水分布均匀。
③ 验证处理过的氧化铝:取标准应用液1.0mL,用氮气吹干,再用石油醚溶解定容至1.0mL。然后按5(3)装柱,将标准溶液加入柱上,按5.(4)净化步骤进行柱色谱,用旋转蒸发瓶收集洗脱出液,浓缩,氮气吹干,用正己烷定容至1.0mL,HPLC测定,记录峰面积或峰高(A)。另取标准应用液直接测定。记录峰面积或峰高(Ar)。将A与Ar进行比较,其值在0.97~1.03之间(A/Ar),则说明柱效较好,氧化铝处理合格。否则需重新进行失活处理。如果再次验证比值仍不能达到0.97,则需重新制备氧化铝。
(14)维生素K1标准:Sigma公司,纯度>98%。
(15)标准贮备液:精确称取50.0mg维生素K1标准,用正己烷溶解定容至50.0mL,即1.0mg/mL。将贮备液分装成安瓿,冷冻保存。
(16)标准工作液:取标准贮备液,用正己烷准确稀释50倍,即20.0μg/mL。
标准工作液的标定:取标准应用液测定紫外吸光值,波长248nm,比色杯厚度1cm,以正己烷为空白,测定3次,取平均值,按下式计算标准应用液浓度。

式中 ρ——维生素K1标准应用液浓度,μg/mL;
A——标准应用液平均紫外吸光值;
E——摩尔消光系数,20000;
Mr——维生素K1相对分子质量450.7;
103——换算成μg/mL的换算系数。
5. 操作步骤(所有操作均需避光进行)
(1)样品处理:
① 新鲜蔬菜:拣净去杂物,将可食部洗净,擦去表面水分,切碎,用打碎机制备成匀浆。
② 干制植物性样品:磨碎,过60目筛。
(2)样品提取:
① 称取已打成匀浆的新鲜样品2~10g(维生素K1含量不低于2μg),加到具塞锥形瓶中,再加入5~10倍体积的丙酮,盖上塞子,振摇3~5min,静置1min,以下按5.(3)步骤步骤操作。
② 称取干制植物性样品0.2~4g(维生素K1含量不低于2μg),加到研钵中,再加入2~4倍于样品量的无水Na2SO4研磨均匀后,加入25mL丙酮,研磨3~5min,静置1min。
[注意:对于细胞壁比较厚的样品,如藻类食品,可先用石英砂研磨,破坏植物组织细胞。石英砂需进行预处理,将石英砂用20目筛子过筛之后,先用浓盐酸浸泡,然后再用稀氢氧化铵浸泡,最后用蒸馏水洗至中性后在烘箱中烤干。使用时,每10g样品加3~5g石英砂于研钵中研磨]
(3)洗涤:将上部澄清液倒入已装有50~100mL 0.14mol/L Na2SO4溶液的分液漏斗中,残渣再用丙酮提取2~3次,每次用量不少于25mL,上清液并入分液漏斗。残渣继续用石油醚洗涤3~4次,每次用量约25mL,至洗涤液呈无色,将洗涤液倒入同一分液漏斗中,振摇1min,静置。弃水相,有机相用蒸馏水洗涤4~5遍,至水相澄清。弃水相,将有机相经无水Na2SO4脱水后转至旋转蒸发瓶中,于60℃水浴中减压蒸馏至约2mL时取下,立即用氮气吹干,用石油醚定容至2.0mL,待净化。
(4)装柱:取干燥色谱柱,将验证好的氧化铝浸泡于石油醚中,湿法填充于色谱柱,使氧化铝自由均匀流下,至柱高为20cm,其上端再加2cm无Na2SO4水。打开活塞,调整流速为每秒1滴。一根色谱柱只用于一个样品测定。
(5)色谱净化:待石油醚流至柱上端0.5cm时,加V1mL样品提取液,当样品液流至柱平齐时,加2mL石油醚冲洗柱壁,流下。再加10mL石油醚洗脱,2次,弃除流出液。然后,用30mL洗脱液洗脱,用旋转蒸发瓶收集流出液。流出液于旋转蒸发器浓缩近干,取下用氮气吹干后,用正己烷定容为V2mL。将定容液移入小塑料离心管中,5000r/min离心5min,上清液供HPLC分析。
(6)标准工作曲线的绘制:分别取维生素K1标准应用液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mL,加入分液漏斗中,按5.(2)步骤提取,浓缩定容至2.0mL。取1.0mL标准提取液按5.(4)步骤操作,最后定容至1.0mL,即标准工作曲线中各点维生素K1含量分别相当于5、10、20、40、60、80、100μg/mL。然后再按5.(6)条件进行HPLC测定,记录峰面积或峰高。以标准含量为横坐标,峰面积或峰高为纵坐标绘制标准工作曲线。
(7)HPLC色谱分析:
色谱条件(推荐条件):
预柱ultrapack ODS,10μm,4.0mm×4.5cm。
分析柱:ultrasphere ODS,C18,5μm,4.6mm×250mm。
流动相:甲醇+正己烷(98+2)。混匀,临用前脱气。
进样量:20μL。
流速1.5mL/min。
紫外检测器:波长248nm。量程0.01~0.05。
HPLC稳定性的测定:取标准应用液连续进行6次HPLC测定,计算峰面积或峰高的平均值、标准差和RSD%,如果RSD<1%,说明仪器稳定性良好。仪器稳定后方可进行样品测定。
(8)样品分析:取样品净化液20μL,按5.(6)条件进行定性、定量测定。
① 定性:用标准色谱峰的保留时间定性。
② 定量:用样品峰面积或峰高在标准工作曲线上查出其相应的维生素K1含量,或用回归方程求出其含量。
6. 计算

式中 X——样品中维生素K1的含量,μg/100g;
m1——由标准工作曲线上查出或回归方程求出的维生素K1含量,μg;
2——样品提取后的定容体积,mL;
V1——样品净化处理时的取液量,mL;
V2——样品净化后的定容体积,mL;
m——样品质量,g。
7. 注意事项
(1)允许差及最小检出量:同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%,本法最小检出限为0.5mg。
(2)本方法避免使用皂化处理,减少了维生素K1的破坏;利用失活的磷酸盐处理过的氧化铝进行色谱分离,通过改变洗脱液的极性使维生素K1与杂质分离,有利于高效液相色谱对维生素K1的定性及定量分析。
(3)维生素K1具有很强的亲脂性,溶于丙酮、石油醚、正己烷、异辛烷等溶剂中,而不易溶于甲醇、乙醇等溶剂中。当样品中含有较多的水分时,如直接用石油醚或正己烷提取会使样品变黏,因此,样品需先用丙酮提取,或先用无水Na2SO4研磨,然后再用丙酮提取,可起到吸收水分的作用,进一步地破坏样品的细胞组织,使提取效果更佳。
(4)以往的报告多选用活性硅胶或中性氧化铝做色谱柱分离维生素K1,再用极性小的有机溶剂作洗脱液。实际工作中发现,用硅胶色谱柱,洗脱流速慢,洗脱液用量大,分离时间较长;用未经处理的氧化铝色谱柱分离会出现维生素K1与干扰物分离不清的现象。当氧化铝用磷酸盐处理后,氧化铝的极性增强,使吸附较小的维生素K1易于被洗脱液洗脱出来,而且在处理后的氧化铝中加入少量水分可以提高柱效,减少维生素K1出峰拖尾的现象,缩短保留了时间,避免了因使用氧化铝造成的维生素K1可能分解的现象。
(5)如果氧化铝色谱柱柱效良好,首选被石油醚洗脱出来的应是胡萝卜素,且柱上没有胡萝卜素黄色带扩散的现象;叶绿素及其他色素停留在色谱柱的上方没有或仅有少量位移但不影响分离效果。
(6)洗脱液中乙醚含量的多少影响着洗脱液的极性,如果乙醚含量少,可使维生素K1的保留时间延长,反之,会使干扰物质被提前洗脱,影响净化效果。所以应严格控制洗脱液中乙醚的比例。
(7)根据标准维生素K1紫外扫描图谱,可见维生素K1于240、248、260、269nm波长处有4个特征峰,其中260nm的峰最低。将标准品用HPLC测定,以260nm波长下的峰面积为1,则240、248nm和269nm波长下的峰面积分别为1.15、1.23、1.09。
(8)一般反相色谱,多用有极性的甲醇作为流动相。在甲醇中加入适量的非极性有机溶剂(如正己烷、异辛烷等),可以增加维生素K1的的溶解能力,有利于缩短保留时间,减少出峰拖尾现象。本方法选择甲醇+正己烷(98+2)作为流动相,维生素K1的保留时间为(15.6±0.1)min。
(9)本方法最小检测限为0.5μg/mL,在1.0~100.0μg/mL范围内与峰面积有良好的线形关系。批间测定结果的相对标准偏差在1.3%~7.1%(n=6);回收率为90.9%~106.3%。不同实验室间测定结果表明此方法精密度、重现性较好,净化效果好,试剂价格适中。