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维生素D的测定方法(高效液相色谱法)


维生素D又称钙(或骨)化醇,系类固醇的衍生物,是一类关系钙、磷代谢的活性物质。自然界中以多种形式存在,如维生素D2、维生素D3、维生素D4、维生素D5、维生素D6、维生素D7等,至少有10种,但主要以维生素D2和维生素D3对动物和人类有营养意义,最为重要,其结构见图4-4。强化食品中强化的维生素D也是维生素D2或维生素D3,食物中也是主要测定维生素D2和维生素D3。由于维生素D不稳定,测定方法复杂,变异大、受影响因素多等特点,目前维生素测定方法主要采用高效液相色谱法。

1. 原理
样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离,以石油醚萃取后,用正相色谱柱提取富集,用反相色谱柱,紫外检测器定量测定。
2. 适用范围
本方法来源于GB/T 5413.9-1997,婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定。适用于食品或强化食品及饲料中的维生素D含量的测定。
3. 主要仪器
(1)高压液相色谱仪,具有可变波长的紫外检测器,数据处理系统或记录仪。
(2)旋转蒸发器。
(3)平底烧瓶:250mL。
(4)分液漏斗:500mL。
4. 试剂
所有试剂,如未注明规格,均指分析纯,所有实验用水均指蒸馏水。
(1)异丙醇:色谱纯。
(2)2%焦性没食子酸乙醇溶液:取2g焦性没食子酸溶于100mL无水乙醇中。
(3)75%氢氧化钾溶液:取75g氢氧化钾溶于100mL水中。
(4)石油醚:沸程30~60℃。
(5)甲醇:色谱纯。
(6)正己烷:色谱纯。
(7)环己烷:色谱纯。
(8)维生素D标准溶液
维生素D2标准贮备液:含维生素D2100μg/mL的甲醇溶液。称取10mg
的维生素D2,用甲醇定溶于100mL容量瓶中。
维生素D3标准贮备液:含维生素D3100μg/mL的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3,用甲醇定溶于100mL容量瓶中。
维生素D标准工作液,其中维生素D2、维生素D3的质量浓度均为1μg/mL。取维生素D2标准贮备液1mL,维生素D3标准贮备液1mL于100mL容量瓶中,用甲醇定容。
5. 操作步骤
(1)样品处理:准确称取10g样品,于250mL平底烧瓶中,加30mL蒸馏水。
(2)测定液的制备:
① 于上述样品溶液中加入100mL的20%没食子酸乙醇溶液,充分混匀后加50mL 75%氢氧化钾溶液,在蒸汽浴上连续回流30min后,立刻冷却到室温。
② 将皂化液转入一500mL分液漏斗中,用100mL水分几次冲洗平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。
③ 于上述分液漏斗中,加入100mL石油醚,盖好瓶塞,倒置分液漏斗并剧烈振摇1min。在振摇过程中,注意释放瓶内压力。静置分层,将水相放入另一500mL分液漏斗中,重复上述萃取过程2次,合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性,通过无水硫酸钠过滤干燥,在40℃和氮气流下,于旋转蒸发器上蒸至近干(绝不允许蒸干)后,用石油醚转移至10mL容量瓶中,定容。
④ 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中,用氮气将石油醚吹干,于试管中加1mL正已烷。
(3)测定:
① 测定液的制备:
a. 仪器条件:
色谱柱:30cm×4mm,硅胶柱。
流动相:正己烷与环己烷按体积比1:1混合,并按体积分数0.8%加入异丙醇。
流速:1mL/min。
波长:265nm。
柱温:20℃。
灵敏度:0.005AU/MV。
注射体积:200μL。
b. 注射50μL维生素D标样和200μL样品溶液,根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中,将试管用氮气吹干,准确加入0.2mL甲醇溶解。
② 测定步骤:
a. 仪器条件:
色谱柱:4.6mm×25cm,C18或具同等性能的色谱柱。
流动相:甲醇。
流速:1mL/min。
波长:265nm。
柱温:20℃。
灵敏度:0.005AU/MV。
注射体积:50μL。
b. 注射50μL维生素D标准溶液,注射50μL样品溶液,得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。
6. 计算
(1)
(2)
式中 X——样品中维生素D,mg/100g;
m——称样量,含量,IU/100g;
ρs——进样液中维生素D的浓度,μg/mL;
As——进样液中维生素D的峰高(或峰面积);
Asd——标样中维生素D的峰高(或峰面积);
ρsd——标样中维生素D的浓度,μg/mL。
计算结果精确至小数点后一位。
7. 举例
如称取AD钙奶10.8g,经皂化、提取后,测得维生素D峰面积为18692,标样峰面积为24767,带入公式计算,得出AD钙奶含维生素D为398.0IU/100g。
8. 注意事项
(1)允许误差及最小检出量:同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10%;最小检出量为0.1国际单位。
(2)试剂焦性没食子酸容易变性,应购买近期生产的试剂。
(3)如果皂化不完全,可适当增加氢氧化钾的加入量。