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薄层色谱法测定食品中牛磺酸


牛磺酸又名牛胆酸或牛胆碱(Taurine),1827年作为牛胆汁的一个组成成分从动物组织中首次分离出来,由此而得名。游离牛磺酸的化学名为α-氨基乙基磺酸,是一种含硫β-氨基酸。
牛磺酸具有保肝利胆、抗惊厥、抗心律失常,调节渗透压、降血压、治疗动脉硬化等多种生理作用,尤其是对婴幼儿的脑、神经、内脏、视网膜、内分泌机能等的发育以及对钙、脂肪和维生素的吸收都具有十分重要的作用。目前,许多国家已把牛磺酸作为一种营养强化剂应用于食品。为了加强食品卫生监督,需要建立食品中牛磺酸的测定方法。考虑我国广大基层单位缺少氨基酸分析仪,我们研究了薄层层析法,本实验所用仪器和试剂都易于购置,是一个值得推广的方法。
1. 仪器与试剂
1.1 仪器 1.5cm×30cm层析柱;蒸发皿1.5cm×20cm薄层板;10μl微量注射器;展开槽;玻璃喷雾器;电吹风。
1.2 试剂 以下试剂均为分析纯。盐酸;氢氧化钠;无水乙醇;正丙醇;冰乙醇;正丁醇;羧甲基纤维素;硅胶G(200目);强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂[001×7(732)];强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂[201×7(717)]。
1%茚三酮乙醇溶液:称取1g茚三酮,加乙醇至100ml。
牛磺酸标准溶液:精确称取牛磺酸标准品40mg,加水溶解并用水定容至100ml,即得含牛磺酸0.4g/L标准溶液。
展开剂:正丙醇-水-冰乙酸-乙醇(5.2+2+2+0.8);正丁醇-水-冰乙酸(4+1+1)。
2. 测定步骤
2.1 离子交换柱的制备
2.1.1 阴离子交换柱:强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂,用乙醇浸泡过夜,再用水漂洗至水层无色。然后填1根1.5cm×10cm高的交换柱,装柱时不要混入气泡,30ml水洗至流出液为中性,然后10ml 1mol/L NaOH过柱,将交换柱处理为强碱性OH-型备用。
2.1.2 二元离子交换柱:先装填1.5cm×8cm漂洗过的阴离子交换树脂,然后再装入1.5cm×8cm的阳离子交换树脂(装前后乙醇浸泡过夜,再用水漂洗至水无色),再加30ml水洗至流出液为中性。
2.2 样品处理
2.2.1 饮料:吸取5.0ml样品通过阴离子交换柱,调流速为30滴/min,待液面降至树脂顶端时,加入水25.0ml洗脱,再加25.0ml 2%HC1洗脱,以上流出液均弃去,最后加入25.0ml 2%HC1洗脱,用蒸发皿接收洗脱液,于100℃水浴挥干,加水5.0ml,充分溶解残渣,过滤,滤液作薄层分析用。
使用过的交换柱,用50ml水快速洗至中性后再用。
2.2.2 谷类食品:称取2.0g已粉碎均匀的样品于25ml具塞量筒中;分别用25、10、10ml水提取3次,每次提取静置15min后,用吸管将上清液转入二元柱,调流速为30滴/min,待流至树脂顶端时,加50ml水淋洗柱子,如果吸取上清液时吸入不溶物使二元柱堵塞,可用长玻棒伸入柱内轻轻搅动。接收全部流出液,将其倒入阴离子交换柱,以下操作除挥干后准确加入2.0ml水溶解残渣外,其余与“2.2.1“饮料项相同。已用过的两根交换柱弃去重填。
2.2.3 奶粉:称取2.0g均匀样品于烧杯中,加入10.0ml水,加热2min溶解(勿使其沸腾),冷却后,倒入二元柱,再用5ml水洗烧杯,洗液亦转入二元柱,调流速为30滴/min,待流至树脂顶端时,加50ml水洗脱。接收全部洗脱液,将其倒入阴离子交换柱,调流速为30滴/min,待流至树脂顶端时,加75ml水、252ml2%HC1洗脱,弃去洗脱液。最后用25ml 2%HC1洗脱,接收全部洗脱液,于水浴挥干后准确加入2.0ml水,充分溶解残渣,弃去洗脱液。最后用25ml 2%HC1洗脱,接收全部洗脱液,于水浴挥干后准确加入2.0ml水,充分溶解残渣,静置后过滤,滤液备作薄层分析用。
2.3 薄层层析
2.3.1 薄层板的制备:称取15g硅胶G,加45ml0.3%羧甲基纤维素钠,铺成0.25mm厚的5cm×20cm薄层板,室温晾干后,于(105±5)℃活化1h后取出,干燥器中保存备用。
2.3.2 占样:在薄层板下端2cm处,用微量注射器点2μl样品溶液,同时点1μl、2μl牛磺酸标准溶液(相当于牛磺酸0.4μg、0.8μg),各点间距1cm。
2.3.3 展开与显色:①饮料及谷类食品:将点好的薄层板放入盛有展开剂展开槽中,展开至12cm(约90min),取出薄层板,晾干。喷显色剂后,于80℃烘箱中烘烤5min,斑点呈粉红至紫红色。根据样品点和标准点的比移值定性,根据斑点大小及颜色深浅进行半定量。②奶粉:奶粉类食品须展开两次,第一次展开16cm(约2h),取出晾干后,再放入展开槽,展开16cm,其余操作同①。
2.4 计算

式中:X-样品中牛磺酸的含量,g/kg或g/L;A-样品斑点相当于牛磺酸的质量,μg;
V1-水浴挥干后加入水的体积,ml;V2-点样体积,μl;m-样品质量或体积,g或ml。
3. 结果与讨论
3.1 操作步骤的评价
3.1.1 提取:牛磺酸为游离状态,易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚,可用水直接提取,勿须水解。
3.1.2 阴离子交换柱净化;牛磺酸虽为两性离子,但在强酸性条件下,不能吸附于阳离子交换树脂上,说明与阳离子交换性很弱。OH-型阴离子交换柱能够吸附牛磺酸,可用水洗去杂质,水洗体积25~75ml不影响牛磺酸的吸附,可视除去杂质的情况而定。之后用酸将牛磺酸洗下。
3.1.3 二元交换柱净化:中性条件下,牛磺酸不保留于二元柱上,但二元柱能够保留其它氨基酸。谷类、奶粉类食品含有氨基酸,能与茚三酮显色剂显色,影响层析效果,因此须经二元柱净化。
3.1.4 展开:由于水浴挥干的程度不同,因此点样液的pH值不等,但经试验,pH并不影响牛磺酸的Rf值。奶粉因其干扰层析的成分较多,所以展开两次,可分开干扰物。
3.2 干扰实验及展开剂的选择
3.2.1 将含有苯丙氯酸、磺基丙氨酸、半胱氨酸、谷酰氨、蛋白糖、牛磺酸、精氨酸、糖精、环己基氨基磺酸的样品(含量各为0.8g/L)通过二元柱、阴离子交换柱净化后,水浴挥干,结果只有牛磺酸一个显色斑点。说明这些干扰物均不干扰层析。
3.2.2 展开剂的选择:当展开剂为正丙醇+水(1+1)时,苯丙氨酸(Rf=0.664)、磺基丙氨酸(Rf=0.684)干扰牛磺酸的薄层层析,牛磺酸的Rf为0.646;当展开剂改为正丙醇+冰醋酸+水+乙醇(5.2+2+2+0.8)时,牛磺酸的R f值为0.37,与其它两种氨基酚分开。从表1中可以看出5号分离较好。
表1 正丙醇:乙酸:水:乙醇系统

序号 比  例 Rf值 结  果
牛磺酸 苯丙氨酸 磺基丙氨酸
1 2.5:2.5:2.5:1 0.51 0.64 0.45 磺基丙氨酸拖尾
2 3.5:2.5:2.5:1 0.54 0.64 0.39 磺基丙氨酸拖尾
3 4.5:2.5:2.5:1 0.43 0.64 0.38 磺基丙氨酸与年磺酸拖尾
4 5.5:2.5:2.5:1 0.40 0.54 0.25 均不拖尾
5 6.5:2.5:2.5:1 0.37 0.58 0.25 均不拖尾

3.3 最低检出量和最低检出限 肉眼可辨最低检出量为0.20μg,最低检出浓度为0.08g/L(kg)。
3.4 加标回收率 选择不含牛磺酸的饮料、奶粉、代乳粉,分别加入0.2g/L(kg)的牛磺酸,依法操作,分别测定8次,结果见表2。
表2 饮料、代乳粉、奶粉中牛磺酸加标目测回收率
食品类 添加量(g/kg) 平均回收率(%)
饮料 0.4 98
0.2 97
代乳粉 0.4 95
0.2 95
0.2 93
奶粉 0.8 93
0.4 92
0.2 93

3.5 样品中牛磺酸的测定 在北京市场上采集了少量饮料、代乳粉、奶粉、并依法测定。结果见表3。
表3 样品中牛磺酸的含量调查表
食品类 样品名称 牛磺酸浓度[g/kg(L)]
饮料 力保健 8.0
红牛饮料 5.3
代乳粉 第1步婴儿全价营养食品 0.28
全营养分儿粉 0.09
奶粉 北大荒AD全脂奶粉 未检出
完达山牌婴儿配方奶粉 0.30
金星婴儿奶粉 0.16

本方法简便、快速,所用仪器和试剂简单,此目测半定量测定方法的回收率高、可测浓度范围宽,能测多种类型食品,适用于基层卫生部门进行牛磺酸营养强化剂的检测。